כרומטוגרפיה היא שיטת אנליזה נפוצה להפרדת תערובת חומרים כימיים למרכיביה הבודדים, כך שניתן לנתח אותם באופן יסודי. יש סוגים רבים של כרומטוגרפיה, ובהם כרומטוגרפיית נוזל, גז, חילופי יונים ועוד - אך כולם משתמשים באותם עקרונות בסיסיים.
כרומטוגרפיה היא טכניקת הפרדה שכל כימאי וביוכימאי אורגני מכיר. לדוגמה נניח שיש לנו שני חומרים מגיבים - A ו-B. נערבב אותם יחד בכלי מתאים וניתן להם להגיב אחד עם השני בתנאים מסוימים, ליצירת חומר שלישי C.
לאחר סיום התגובה, נוצרת תערובת שמכילה את חומר A ללא תגובה, חומר B ללא תגובה והמוצר הרצוי C. כעת המשימה היא להפריד את A, B ו-C כדי לבודד ולנתח את המוצר הטהור C.
ראשית, כפי שמוצג בצד שמאל, מבצעים כרומטוגרפיה ברובד דק (TLC). זוהי בעצם חתיכה מלבנית של צלחת זכוכית, מצופה בשכבה דקה של סיליקה. מניחים כתם של תערובת התגובה ממש מעל בסיס הצלחת (מסומן בקו מוצק), ולאחר מכן מניחים את הצלחת בצנצנת שמכילה חומר ממס אורגני מתאים עם מספיק נפח כדי לטבול את הקצה התחתון של הצלחת. בהדרגה, על ידי פעולה נימית, הממס מתחיל לעלות במעלה צלחת הסיליקה, ותערובת התגובה נפרדת ל-3 נקודות עם צבעים ברורים - עד שהממס מגיע לסמן הקדמי.
לאחר מכן, על מנת לבצע בפועל את ההפרדה, מתקינים עמוד זכוכית (כפי שמוצג בצד ימין של התמונה) עם ברז המחובר בתחתית, מכניסים פקק צמר גפן בתחתית העמוד ואורזים את העמוד בתערובת של סיליקה ג'ל (שהוכן בממס אורגני).
לאחר שהעמודה נארזה, ונפח הממס מעל המצע הצטמצם לפחות מ-5 מ"מ, שופכים בזהירות את תערובת התגובה על מצע הסיליקה מהחלק העליון של העמודה, בעזרת פיפטת זכוכית. פותחים את הברז ונותנים לממס לזרום לאט בעמוד. במשך כל הזמן הזה ממשיכים להוסיף ממס מהחלק העליון של עמוד הזכוכית.
תערובת התגובה מתחילה להיפרד לשלוש רצועות ברורות - צהוב, ורוד וכתום התואמות ל-B שלא הגיב, ל-A ולמוצר הרצוי C, בהתאמה. אוספים יחידות בודדות בצלוחיות נפרדות וכך משיגים חומר C טהור.
עקרונות הבסיס של כרומטוגרפיה
בואו נכיר תחילה כמה מונחים המשמשים בדרך כלל בהקשר של כרומטוגרפיה:
פאזה ניידת (Mobile phase / Carrier) - חומר ממס נע בחלל הצינור.
פאזה נייחת (Stationary phase / adsorbent) - חומר נייח שנשאר קבוע בתוך הצינור.
נוזל ממס (Eluent) שנכנס לצינור.
נוזל היוצא מהעמוד (Eluate) ונאסף בצלוחיות.
השטפה (Elution) - שטיפת התרכובת דרך הצינור באמצעות ממס מתאים.
תוצר / אנליט (Analyte) שיש להפריד ולנתח את מרכיביו הבודדים.
כעת נסביר את העיקרון הבסיסי של כרומטוגרפיה באמצעות הפרדת עמודות כרומטוגרפית.
האנליט מוטען על מצע הסיליקה (ארוז בעמודה) ומאפשר להיצמד לסיליקה. הסיליקה פועלת כאן כשלב נייח. לאחר מכן גורם ממס (שלב נייד) זורם דרך מצע הסיליקה תחת כוח הכבידה או לחץ. המרכיבים השונים של האנליט מציגים דרגות שונות של הידבקות לסיליקה, וכתוצאה מכך הם נעים במהירויות שונות דרך השלב הנייח כאשר הממס זורם דרכו, דבר המעיד על הפרדת הרצועות השונות.
הרכיבים הנצמדים חזק יותר לשלב הנייח, נעים לאט יותר בהשוואה לאלה עם הידבקות חלשה יותר. ניתן להשתמש בכרומטוגרפיה אנליטית לטיהור תרכובות החל ממיליגרם ועד סולם גרם.
עקרון הפרדה של רכיבים שונים: זיקה דיפרנציאלית (חוזק הידבקות) של מרכיבי האנליט השונים לחומר הנייח והנייד, מביאה להפרדה דיפרנציאלית של הרכיבים. זיקה, בתורה, מוכתבת על ידי שתי תכונות של המולקולה: 'ספיחה' ו'מסיסות'.
אנו יכולים להגדיר ספיחה כתכונה של עד כמה רכיב של התערובת נצמד לשלב הנייח, בעוד שמסיסות היא התכונה של עד כמה רכיב של התערובת מתמוסס בשלב הנייד.
ככל שהספיחה לשלב הנייח גבוהה יותר, כך המולקולה תעבור לאט יותר בעמודה. ככל שהמסיסות גבוהה יותר בשלב הנייד, כך המולקולה תעבור מהר יותר בעמודה. משחק הגומלין בין שני הגורמים לעיל קובע את קצב ההפרשים בהם המרכיבים השונים של האנליט יעברו בעמודה.
ניתן לתמרן ספיחה ומסיסות של מולקולה על ידי בחירת הפאזה הנייחת והפאזה הניידת המתאימה. כעת נשאלת השאלה מדוע לתרכובות שונות יש זיקה שונה לשלבים הנייחים והניידים? ה"קוטביות" של התרכובות מכתיבה את הזיקה שלהם לשלבים הנייחים והניידים.
לדוגמה - נניח שיש לנו תערובת של שתי מולקולות A ו-B, כאשר 'A' הוא חלבון ו-'B' הוא ליפיד. עמודת הזכוכית עמוסה בסיליקה, שהיא קוטבית באופיה; השלב הנייד שלנו הוא הקסאן, שהוא לא קוטבי בטבעו. מה יקרה כשנעמיס את התערובת הזו של A ו-B בעמודת הזכוכית?
חומר 'A', בהיותו קוטבי באופיו, ייספג לשלב הקוטבי הנייח (סיליקה). 'B', בהיותו לא קוטבי בטבעו, יתמוסס בקלות בפאזה הניידת הלא קוטבית (הקסאן) בלי להיצמד לסיליקה, ובכך יישטף החוצה עם הקסאן. ברגע ש-B ייפלט החוצה, השלב הנייד ישתנה למשהו קוטבי כמו אצטוטריל. כך נאלץ כעת את A להתנתק מהסיליקה ולהתמוסס בממס הקוטבי, אצטוניטריל, ולהיחלץ מהעמודה עם אצטוניטריל.
סוגים של כרומטוגרפיה
לאורך מאמר זה אנו עוסקים בכרומטוגרפיה של פאזה רגילה, מה שמרמז שהשלב הנייח קוטבי (הידרופילי) בטבעו, והשלב הנייד אינו קוטבי (הידרופובי). עבור יישומים מיוחדים, מדענים משתמשים לפעמים בטכניקות כרומטוגרפיות של פאזה הפוכה עם תרחיש הפוך - כלומר השלב הנייח אינו קוטבי והשלב הנייד קוטבי.
יש מספר סוגים של הפרדה כרומטוגרפית, כל אחד שונה בסוג הפאזה הנייחת והניידת בהן משתמשים. העיקרון הבסיסי נשאר זהה: זיקה דיפרנציאלית של המרכיבים השונים של האנליט אל השלבים הנייחים והניידים, גורמת להפרדה דיפרנציאלית של הרכיבים.
שוב, אופן האינטראקציה של הרכיבים השונים עם השלבים הנייחים והניידים עשוי להשתנות בהתאם לטכניקה הכרומטוגרפית בה משתמשים.
הטכניקות הכרומטוגרפיות הנפוצות הן:
שיטה | פאזה נייחת | פאזה ניידת | בסיס ההפרדה | הערות |
כרומטוגרפיית נייר* | מוצקה (צלולוזה) | נוזלית | קוטביות המולקולות | הרכיב נצפה ישירות על נייר הצלולוזה |
כרומטוגרפיית רובד דק (TLC)* | מוצקה (סיליקה / אלומינה) | נוזלית | קוטביות המולקולות | הרכיב נצפה על גבי שכבת סיליקה על הזכוכית |
כרומטוגרפיית נוזל* | מוצקה (סיליקה / אלומינה) | נוזלית | קוטביות המולקולות | עמודת הזכוכית עמוסה בתרחיץ סיליקה |
כרומטוגרפיית גודל המולקולה | מוצקה (כדורי סיליקה מיקרו-נקבוביים) | נוזלית | גודל המולקולות | מולקולות קטנות נלכדות בנקבוביות הפאזה הנייחת, ומולקולות גדולות זורמות דרך הרווחים בין החרוזים. המולקולות הגדולות יותר יוצאות ראשונות. אין שום אינטראקציה, פיזית או כימית, בין האנליט לשלב הנייח |
כרומטוגרפיית חילופי יונים | מוצקה (שרף קטיוני או אניוני) | נוזלית | המטען החשמלי של היונים | מולקולות עם מטען הפוך לשרף - ייקשרו אליו בחוזקה; ומולקולות בעלות מטען זהה לשרף - יזרמו דרך העמודה ויפלטו החוצה ראשונות |
כרומטוגרפיית זיקה | מוצקה (אגרוז או חרוזי סיליקה נקבוביים שעליהם נטמעות מולקולות כמו אנזימים ונוגדנים) | נוזלית | הזיקה קושרת נוזל של מולקולת האנליט למולקולה המוטמעת על השלב הנייח | אם מולקולה היא מצע לאנזים, היא תיקשר אליו בחוזקה. האנליטים הבלתי קשורים יעברו בשלב הנייד ויפלטו החוצה מהעמוד, ללא הסובסטרט הקשור לאנזים, שלאחר מכן ניתן לנתק מהשלב הנייח ולחלץ החוצה מהעמודה עם ממס מתאים |
כרומטוגרפיית גז | תמיכה נוזלית או מוצקה | גז (אינרטי כגון ארגון או הליום) | נקודת הרתיחה של המולקולות | הדגימות מתנדפות והמולקולה עם נקודת הרתיחה הנמוכה ביותר יוצאת ראשונה מהעמודה, והגבוהה ביותר יוצאת אחרונה |
* מוגדרת כ"כרומטוגרפיית נוזלים"
כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה (HPLC)
תת-סוג של כרומטוגרפיית נוזל, בו התערובת בפאזה הניידת מוזרקת בלחץ גבוה אל עמודת הזכוכית. זהו סוג הכרומטוגרפיה הנפוץ ביותר (80 אחוזים מכל ההפרדות מבוצעות בשיטה זו).
Comments